在过去的二十年里，二次谐波（Second harmonic generation, SHG）显微镜已成为光学成像的关键方法，在材料和生物医学科学中有许多应用[1]。SHG基于二阶非线性光学过程，只有在具有非中心对称结构的物质中产生信号，这一特殊的成像要求使得SHG显微镜具有高度特异性。胶原蛋白是人体组织中最常见的蛋白质之一，在分子尺度上，胶原蛋白由三条α链组成（图1），在某些胶原类型（主要是 I 型和 II型）中，这些三螺旋自发地自我组装成高度有组织的胶原纤维，从而产生非常强的 SHG 信号，而非纤维胶原（如IV型）无法通过SHG显微镜成像。

图1 胶原蛋白的层次结构[1]SHG过程的相干性使得SHG图像中蕴含着生物样本丰富的信息，下面简述几种先进SHG显微镜技术[1]。

Forward over backward second harmonic generation (F/B?SHG) [1]SHG信号一般分为前向F-SHG (Forward SHG, F-SHG)信号和后向B-SHG (Borward SHG, B-SHG)信号。由于SHG信号的产生是一个相干过程，因此相位信息至关重要。在生物样本中一般很难满足相位匹配条件，对于F-SHG 信号，相干长度L_C（几微米）较大，能较好地展示在SHG波长量级的有序结构，而B-SHG信号的相干长度L_C（几十纳米）较小，因此纯B-SHG一般非常微弱，能很好地展示更小的一些结构。F/B?SHG显微镜能够充分利用SHG辐射模式方向性的优势。图2(a-d)说明随着偶极子（绿色箭头）在焦点体积处的堆叠，相比于B-SHG，F-SHG强度会更大。图2(e, f)分别是肌腱组织前向和后向SHG图像，图2(g, h)分别表示沿着纵向和横向两个方向时，前向和后向SHG信号的变化。

图2 F/B SHG成像原理及结果示例[1]

Polarization?resolved second harmonic generation (P?SHG)[1]胶原纤维一般为圆柱形，如果输入激光为线偏振光且沿着z轴传输，线偏振光相对于x轴的偏振角度为μ，胶原纤维相对于x轴的方位角为θ（具体见图3(a)），那么图像中每个像素的SHG信号强度如下：公式(1)说明改变入射光偏振角度会极大地影响SHG信号强度，SHG信号强度中包含生物组织大分子的取向信息。P-SHG 结合了 SHG 显微镜（高特异性和高对比度）和偏振测量法（对分子排列的敏感性）的优点，可以应用于胶原蛋白，能更准确地揭示图像平面上纤维的复杂层次结构。图3(a)是P-SHG显微镜装置图，其中1/4波片和半波片起到优化激光线偏振程度和改变线偏振光偏振角度的作用，图3(b)是利用P-SHG显微镜量化平面内胶原纤维取向的结果示例。

图3 (a)典型P-SHG显微镜装置示意图，(b) P-SHG显微镜测量成年马标本的胶原纤维取向Circular dichroism second harmonic generation (CD?SHG)[1]除了P-SHG外，使用左旋和右旋圆偏振激光还能提取圆二色性 SHG，其信号强度定义为：与线性显微镜检测到的圆二色性一样，CD-SHG也要求光学活性不为零（这与手性对称有关）。CD-SHG可以用来检测三维胶原蛋白极性，如图4是对人类角膜横向切面胶原蛋白成像。

图4 应用 CD-SHG 对人体角膜横向成像的示例Stokes vector–based second harmonic generation microscopy[1]SHG显微镜可以表征不同线偏振光下样品的响应，CD-SHG显微镜可以表征不同圆偏振光下样品的响应，但这些方法没有提供样品对全部偏振的响应（如不相干、部分偏振和非偏振光），而斯托克斯-穆勒矩阵形式更能完整描述材料的偏振响应。光的偏振状态可以通过4×1斯托克斯向量S得到完整描述，其中不同的下标表示在入射激光偏振处于0°，90°，45°，-45°及左右旋偏振下SHG信号强度。基于，矩阵的四个元素被归一化，都处于-1至1区间。从向量S中可以描述多个重要的偏振参数，如偏振度（DOP）、线偏振度（DOLP）和圆偏振度（DOCP）。图5展示了用这种方法对胶原纤维成像的结果，揭示了胶原纤维更全面的取向信息。基于斯托克斯向量的SHG显微镜的主要缺点之一是它仅限于前向检测配置，因此样品较薄。此外，该方法假设入射激光和 SHG 信号之间存在线性关系，但仍然无法提供样品的完整偏振响应。

图 5 用基于斯托克斯向量的SHG显微镜对胶原纤维成像[1]Interferometric second harmonic generation (I?SHG)[1]SHG的相干性质有利于提供有关样本的额外信息，但它也是一个弱点，因为 SHG 图像上看到的图案来自复杂的干扰，这可能导致严重的成像伪影，并隐藏生物样本实际的底层结构（如图2(e)和2(f)中黑色的区域）。因此，为了提取定量信息，有必要去测量样品内部的局部极性。观察公式(4)，符号的反转会导致发射的SHG信号存在π相移，这表明信号的相位保留了样本内极性的特征，该特征可以映射到图像的每个像素中。SHG可通过直接测量相位来探测谐波分子的相对极性。该方法依赖于两个 SHG 信号的结合，一个来自放置在显微镜前的参考非线性晶体（），另一个来自样品（），它们相互干涉（见图6（a））。由于两个 SHG 光束在空间和时间上都是相干的，因此探测器上的总强度遵循通常的双波干涉方程：

图6  I-SHG装置及成像程序[1]通过调整两束光束之间的相位差，可以记录干涉图，并通过拟合实验曲线（图6（d））提取余弦幅角（即相对相位）及其乘积因子（干涉对比度）。Wide?field SHG imaging[1]扫描SHG成像是一种成熟的方法，多年来已成功应用于许多应用，这种方法存在实施限制—每秒每帧检测到的光子数较少。这一缺点阻碍了其应用于非常快速的生物过程（毫秒时间尺度）的无标记成像。为了克服这一限制，宽场SHG成像应运而生，如图7所示，样品被放置在焦点的略上方，从而获得更大的视场。此时，整个感兴趣的区域同时被照亮，能够实现并行化光子发射。

图7 典型的宽场显微镜装置[1]本篇综述介绍了各种先进的SHG成像技术，这些技术充分利用了SHG相干性、层析能力和图像对比度高等优势，在胶原蛋白、微管、神经细胞等生物组织的研究中大放光彩。SHG和非线性光学显微镜成像模式能提供大量信息，而这些信息是传统线性或非相干光学成像技术无法轻易获得的。随着光学、机器学习和激光技术的进步，非线性成像模式会随着时间的推移变得更好、更简单，为基础科学和生物医学的广泛应用开辟新的视野。

参考文献：[1] Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M. et al. Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev 15, 43–70 (2023).

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十六 强大的SHG生物医学成像技术